市場監(jiān)管總局關(guān)于征求《保健食品毒理學(xué)評價(jià)程序（征求意見稿）》等意見

附件1

保健食品及其原料毒理學(xué)評價(jià)程序

（征求意見稿）

本程序適用于保健食品及其原料的毒理學(xué)安全性評價(jià)。

1 術(shù)語

1.1 保健食品

是指聲稱保健功能，不得對人體產(chǎn)生急性、亞急性或者慢性危害的特殊食品。包括屬于補(bǔ)充維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的營養(yǎng)素補(bǔ)充劑，以及聲稱保健功能的產(chǎn)品。

1.2 保健食品原料

形成保健食品功效成分和配方的初始物料。

2受試物

2.1 受試物可以是保健食品或保健食品原料。

2.2 資料性要求

2.2.1應(yīng)提供受試物的名稱、性狀、規(guī)格、批號、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、保存條件、申請單位名稱、生產(chǎn)企業(yè)名稱、配方、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、保健功能以及推薦攝入量等信息。

2.2.2 受試物為保健食品原料時(shí)應(yīng)提供動物和植物類原料的產(chǎn)地和食用部位、微生物類原料的分類學(xué)地位和生物學(xué)特征、食用條件和方式、食用歷史、食用人群等基本信息，以及其他有助于安全性評估的資料。

2.2.3原料為從動物、植物、微生物中分離的成分時(shí)，還需提供該成分的理化特性和化學(xué)結(jié)構(gòu)等資料。

2.2.4 提供受試物的主要成分、功效成分/標(biāo)志性成分及可能的有害成分的分析報(bào)告。

2.3 受試物的特殊要求

2.3.1保健食品應(yīng)提供包裝完整的定型產(chǎn)品。毒理學(xué)試驗(yàn)所用樣品批號應(yīng)與功能學(xué)試驗(yàn)所用樣品批號一致，并且為衛(wèi)生學(xué)試驗(yàn)所用三批樣品之一（益生菌、奶制品等產(chǎn)品保質(zhì)期短于整個(gè)試驗(yàn)周期的產(chǎn)品除外）。根據(jù)技術(shù)審評意見要求補(bǔ)做試驗(yàn)的，若原批號樣品已過保質(zhì)期，可使用新批號的樣品實(shí)驗(yàn)，但應(yīng)提供新批號樣品按產(chǎn)品技術(shù)要求檢驗(yàn)的全項(xiàng)目檢驗(yàn)報(bào)告。

2.3.2 由于推薦量較大等原因不適合直接以定型產(chǎn)品進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，可以對送檢樣品適當(dāng)處理，如濃縮、部分去除輔料或已知安全的食品成分等。應(yīng)提供受試樣品處理過程的說明和相應(yīng)的證明文件，處理過程應(yīng)與原保健食品的主要生產(chǎn)工藝步驟保持一致。

3. 毒理學(xué)試驗(yàn)的主要項(xiàng)目

依據(jù)GB15193開展下列試驗(yàn)。

3.1急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

3.2遺傳毒性試驗(yàn)：細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)，體內(nèi)哺乳動物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)，哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)，小鼠精原細(xì)胞或精母細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)，體外哺乳類細(xì)胞HGPRT基因突變試驗(yàn)，體外哺乳類細(xì)胞TK基因突變試驗(yàn)，體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)、嚙齒類動物顯性致死試驗(yàn)，體外哺乳類細(xì)胞DNA損傷修復(fù)（非程序性DNA合成）試驗(yàn)，果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)。

遺傳毒性試驗(yàn)組合：一般應(yīng)遵循原核細(xì)胞與真核細(xì)胞、體內(nèi)與體外試驗(yàn)相結(jié)合的原則，并包括不同的終點(diǎn)（誘導(dǎo)基因突變、染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化），推薦下列遺傳毒性試驗(yàn)組合：

組合一：細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)；哺乳動物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)或哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)；小鼠精原細(xì)胞或精母細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)或嚙齒類動物顯性致死試驗(yàn)。

組合二：細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)；哺乳動物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)或哺乳動物骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)；體外哺乳類細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)或體外哺乳類細(xì)胞TK基因突變試驗(yàn)。

根據(jù)受試物的特點(diǎn)也可用其他體外或體內(nèi)測試替代推薦組合中的一個(gè)或多個(gè)體外測試。

3.3 28天經(jīng)口毒性試驗(yàn)

3.4 致畸試驗(yàn)

3.5 90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)

3.6生殖毒性試驗(yàn)

3.7毒物動力學(xué)試驗(yàn)

3.8慢性毒性試驗(yàn)

3.9致癌試驗(yàn)

3.10 慢性毒性和致癌合并試驗(yàn)

4. 毒性試驗(yàn)的選擇

4.1 保健食品原料

需要開展安全性評價(jià)的保健食品原料應(yīng)參照新食品原料安全性審查的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

4.2 保健食品

4.2.1保健食品一般應(yīng)進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、三項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)和28天經(jīng)口毒性試驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和目標(biāo)人群決定是否增加90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)、致畸試驗(yàn)和生殖毒性試驗(yàn)、慢性毒性和致癌試驗(yàn)及毒物動力學(xué)試驗(yàn)。

4.2.2采用導(dǎo)致物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生重大改變等非傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的保健食品，應(yīng)進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、三項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)、90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)和致畸試驗(yàn)，必要時(shí)開展其他毒性試驗(yàn)。

4.2.3 以普通食品、保健食品原料目錄內(nèi)的物質(zhì)為原料，僅采用物理粉碎或水提等傳統(tǒng)食品生產(chǎn)工藝生產(chǎn)、食用方法與傳統(tǒng)食用方法相同，且原料推薦食用量為常規(guī)用量或符合國家相關(guān)食品用量規(guī)定的保健食品，一般可不開展毒性試驗(yàn)。

5. 特定產(chǎn)品的毒理學(xué)設(shè)計(jì)要求

5.1 如產(chǎn)品配方中含有人體必需營養(yǎng)素或已知存在安全問題等物質(zhì)，如某一過量攝入易產(chǎn)生安全性問題的人體必需營養(yǎng)素等物質(zhì)（如維生素A、硒等）或已知存在安全問題物質(zhì)（如咖啡因等），在按其推薦量設(shè)計(jì)試驗(yàn)劑量時(shí)，如該物質(zhì)的劑量達(dá)到已知的毒性作用劑量，在原有劑量設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，應(yīng)考慮增設(shè)去除該物質(zhì)或降低該物質(zhì)劑量（如降至未觀察到有害作用劑量）的受試物劑量組，以便對受試物中其他成分的毒性作用及該物質(zhì)與其他成分的聯(lián)合毒性作用做出評價(jià)。

5.2推薦量較大的含乙醇的受試物，在按其推薦量設(shè)計(jì)試驗(yàn)劑量時(shí)，如超過動物最大灌胃容量，可以進(jìn)行濃縮。乙醇濃度低于15％（V/V)的受試物，濃縮后應(yīng)將乙醇恢復(fù)至受試物定型產(chǎn)品原來的濃度。乙醇濃度高于15％的受試物，濃縮后應(yīng)將乙醇濃度調(diào)整至15％，并將各劑量組的乙醇濃度調(diào)整一致。不需要濃縮的受試物，其乙醇濃度高于15％時(shí)，應(yīng)將各劑量組的乙醇濃度調(diào)整至15％。在調(diào)整受試物的乙醇濃度時(shí)，原則上應(yīng)使用生產(chǎn)該受試物的酒基，無法達(dá)到定型產(chǎn)品的濃度時(shí)，可用食用酒精。

5.3針對適宜人群為孕婦、乳母或兒童的產(chǎn)品，應(yīng)特別關(guān)注是否存在生殖毒性和發(fā)育毒性，必要時(shí)還需檢測某些神經(jīng)毒性和免疫毒性指標(biāo)。

5.4對益生菌、真菌等有特殊規(guī)定的保健食品，應(yīng)按規(guī)定增加相應(yīng)的試驗(yàn)，如毒力試驗(yàn)。

6.動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)共性問題

6.1 受試物的前處理

6.1.1 袋泡茶類受試物的提取方法應(yīng)與產(chǎn)品推薦飲用的方法相同，可用該受試物的水提取物進(jìn)行試驗(yàn)。如果產(chǎn)品無特殊推薦飲用方法，水提取物可采用以下提取條件進(jìn)行：常壓、溫度80 ℃～90 ℃，浸泡時(shí)間30 min，水量為受試物質(zhì)量的10倍或以上，提取2次，將提取液合并濃縮至所需濃度，并標(biāo)明該濃縮液與原料的比例關(guān)系。如產(chǎn)品有特殊推薦服用方法（如推薦食用浸泡后的產(chǎn)品），在試驗(yàn)時(shí)予以考慮。

6.1.2  液體受試物需要進(jìn)行濃縮處理時(shí)，應(yīng)采用不破壞其中有效成分的方法?？墒褂脺囟?/span>60 ℃～70 ℃ 減壓或常壓蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥等方法。液體受試物經(jīng)濃縮后達(dá)到人體推薦量的試驗(yàn)要求，但不能通過灌胃給予的，容許以摻入飼料的方式給予實(shí)驗(yàn)動物。 

6.1.3不易粉碎的固體受試物（如含膠基、蜜餞類）可用凍干粉碎的方式處理，并在試驗(yàn)報(bào)告中詳細(xì)說明。

6.1.4含益生菌或其他微生物的受試物在進(jìn)行細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)或體外細(xì)胞試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)將微生物滅活，并說明具體方法。

6.1.5對人體推薦量較大的受試物，在按其推薦量設(shè)計(jì)試驗(yàn)劑量時(shí)，如超過動物的最大灌胃容量或超過摻入飼料中的限量（10％（w/w）），可允許去除無安全問題的部分輔料進(jìn)行試驗(yàn)，并在試驗(yàn)報(bào)告中詳細(xì)說明。

6.1.6吸水膨脹率較高的受試物應(yīng)考慮吸水膨脹對受試物給予劑量和實(shí)驗(yàn)動物的影響，以此來選擇合適的受試物給予方式（灌胃或摻入飼料）。如采用灌胃方式給予，應(yīng)選擇水為溶媒。

6.2受試物的給予方式

6.2.1 受試物應(yīng)經(jīng)口給予。根據(jù)受試物的性質(zhì)及人體推薦攝入量，選擇摻入飼料或飲水、灌胃的方式給予受試物。應(yīng)詳細(xì)說明受試物配制方法、給予方法和時(shí)間。

6.2.2 灌胃給予受試物時(shí)，應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和受試物的理化性質(zhì)選擇適合的溶媒（溶劑、助懸劑或乳化劑），將受試物溶解或懸浮于溶媒中，一般可選用蒸餾水、植物油、淀粉、明膠、羧甲基纖維素、蔗糖脂肪酸酯等，如使用其他溶媒應(yīng)說明理由。所選用的溶媒本身應(yīng)不產(chǎn)生毒性作用；與受試物各成分之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且保持其穩(wěn)定性；無特殊刺激性或氣味。

6.2.3 摻入飼料或飲水方式給予受試物時(shí)，應(yīng)保證受試物的穩(wěn)定性和均一性及飼料的適口性，以不影響動物攝食、營養(yǎng)均衡和飲水量為原則。當(dāng)受試物在飼料中的最大加入量超過5%（w/w）時(shí)，需考慮動物的營養(yǎng)需要，結(jié)合受試物的蛋白質(zhì)含量將各組飼料蛋白質(zhì)水平調(diào)整一致，并說明具體調(diào)整方法。原則上添加的受試物最高不超過飼料的10%（w/w），否則應(yīng)說明理由。

6.3實(shí)驗(yàn)動物的選擇

實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)符合相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)的要求，同時(shí)結(jié)合保健功能（如減肥、輔助降血脂等）的特點(diǎn)來選擇實(shí)驗(yàn)動物的品系、性別和年齡等。

7. 試驗(yàn)結(jié)果的判定與應(yīng)用

7.1 急性毒性試驗(yàn)

如LD₅₀小于人的推薦（可能）攝入量的100倍，則一般應(yīng)放棄該受試物用于保健食品，不再繼續(xù)進(jìn)行其他毒理學(xué)試驗(yàn)。

7.2 遺傳毒性試驗(yàn)

7.2.1如三項(xiàng)試驗(yàn)均為陰性，則可繼續(xù)進(jìn)行下一步的毒性試驗(yàn)。

7.2.2如遺傳毒性試驗(yàn)組合中兩項(xiàng)或以上試驗(yàn)陽性，則表示該受試物很可能具有遺傳毒性和致癌作用，一般應(yīng)放棄該受試物應(yīng)用于保健食品。

7.2.3 如遺傳毒性試驗(yàn)組合中一項(xiàng)試驗(yàn)為陽性，根據(jù)其遺傳毒性終點(diǎn)、結(jié)合受試物的結(jié)構(gòu)分析、化學(xué)反應(yīng)性、生物利用度、代謝動力學(xué)、靶器官等資料綜合分析，再選兩項(xiàng)備選試驗(yàn)（至少一項(xiàng)為體內(nèi)試驗(yàn)）。如再選的試驗(yàn)均為陰性，則可繼續(xù)進(jìn)行下一步的毒性試驗(yàn)；如其中有一項(xiàng)試驗(yàn)陽性，則應(yīng)放棄該受試物應(yīng)用于保健食品。

7.3  28天經(jīng)口毒性試驗(yàn)

對只需要進(jìn)行急性毒性、遺傳毒性和28天經(jīng)口毒性試驗(yàn)的受試物，若試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)有明顯毒性作用，綜合其他各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果可做出初步評價(jià)；若試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有明顯毒性作用，尤其是有劑量—反應(yīng)關(guān)系時(shí)，則一般應(yīng)放棄該受試物用于保健食品。

7.4 90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)所得的未觀察到有害作用劑量進(jìn)行評價(jià)，原則是：

a)未觀察到有害作用劑量小于或等于人的推薦（可能）攝入量的100倍表示毒性較強(qiáng)，一般應(yīng)放棄該受試物用于保健食品。

b)未觀察到有害作用劑量大于100倍而小于300倍者，應(yīng)進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)。

c)未觀察到有害作用劑量大于或等于300倍者則不必進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)，可進(jìn)行安全性評價(jià)。

7.5致畸試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果評價(jià)受試物是不是實(shí)驗(yàn)動物的致畸物。若致畸試驗(yàn)結(jié)果陽性則不再繼續(xù)進(jìn)行生殖毒性試驗(yàn)和生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)。在致畸試驗(yàn)中觀察到的其他發(fā)育毒性，應(yīng)結(jié)合28天和（或）90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評價(jià)。

7.6生殖毒性試驗(yàn)和生殖發(fā)育毒性試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)所得的未觀察到有害作用劑量進(jìn)行評價(jià)，原則是：

a)未觀察到有害作用劑量小于或等于人的推薦（可能）攝入量的100倍表示毒性較強(qiáng)，應(yīng)放棄該受試物用于保健食品。

b)未觀察到有害作用劑量大于100倍而小于300倍者，應(yīng)進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)。

c) 未觀察到有害作用劑量大于或等于300倍者則不必進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)，可進(jìn)行安全性評價(jià)。

7.7 慢性毒性和致癌試驗(yàn)

7.7.1根據(jù)慢性毒性試驗(yàn)所得的未觀察到有害作用劑量進(jìn)行評價(jià)的原則是：

a)未觀察到有害作用劑量小于或等于人的推薦（可能）攝入量的50倍者，表示毒性較強(qiáng)，應(yīng)放棄該受試物用于保健食品。

b)未觀察到有害作用劑量大于50倍而小于100倍者，經(jīng)安全性評價(jià)后，決定該受試物可否用于食品。

c)未觀察到有害作用劑量大于或等于100倍者，則可考慮允許使用于保健食品。 

7.7.2根據(jù)致癌試驗(yàn)所得的腫瘤發(fā)生率、潛伏期和多發(fā)性等進(jìn)行致癌試驗(yàn)結(jié)果判定的原則是（凡符合下列情況之一，可認(rèn)為致癌試驗(yàn)結(jié)果陽性。若存在劑量反應(yīng)關(guān)系，則判斷陽性更可靠）：

a)腫瘤只發(fā)生在試驗(yàn)組動物，對照組中無腫瘤發(fā)生。

b)試驗(yàn)組與對照組動物均發(fā)生腫瘤，但試驗(yàn)組發(fā)生率高。

c)試驗(yàn)組動物中多發(fā)性腫瘤明顯，對照組中無多發(fā)性腫瘤，或只是少數(shù)動物有多發(fā)性腫瘤。

d)試驗(yàn)組與對照組動物腫瘤發(fā)生率雖無明顯差異，但試驗(yàn)組中發(fā)生時(shí)間較早。

致癌試驗(yàn)結(jié)果陽性應(yīng)放棄將該受試物用于保健食品。

8.安全性綜合評價(jià)時(shí)需要考慮的因素

8.1 試驗(yàn)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、生物學(xué)意義和毒理學(xué)意義

對實(shí)驗(yàn)中某些指標(biāo)的異常改變，應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)組與對照組指標(biāo)是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異、其有無劑量反應(yīng)關(guān)系、同類指標(biāo)橫向比較、兩種性別的一致性及與本實(shí)驗(yàn)室的歷史性對照值范圍等，綜合考慮指標(biāo)差異有無生物學(xué)意義，并進(jìn)一步判斷是否具毒理學(xué)意義。此外，如在受試物組發(fā)現(xiàn)某種在對照組沒有發(fā)生的腫瘤，即使與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，仍要給予關(guān)注。

8.2 人體推薦（可能）攝入量較大的受試物

一方面，若受試物摻入飼料的最大加入量（原則上最高不超過飼料的10%）或液體受試物經(jīng)濃縮后仍達(dá)不到未觀察到有害作用劑量為人體推薦（可能）攝入量的規(guī)定倍數(shù)時(shí)，綜合其他的毒性試驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際食用或飲用量進(jìn)行安全性評價(jià)。另一方面，應(yīng)考慮給予受試物量過大時(shí)，可能通過影響營養(yǎng)素?cái)z入量及其生物利用率、從而導(dǎo)致某些與受試物無關(guān)的毒理學(xué)表現(xiàn)。

8.3時(shí)間-毒性效應(yīng)關(guān)系

對由受試物引起實(shí)驗(yàn)動物的毒性效應(yīng)進(jìn)行分析評價(jià)時(shí)，要考慮在同一劑量水平下毒性效應(yīng)隨時(shí)間的變化情況。

8.4 人群資料

由于存在著動物與人之間的物種差異，在評價(jià)食品的安全性時(shí)，應(yīng)盡可能收集人群接觸受試物后的反應(yīng)資料。人體的毒物動力學(xué)或代謝資料對于將動物試驗(yàn)結(jié)果推論到人具有很重要的意義。

8.5 動物毒性試驗(yàn)和體外試驗(yàn)資料

本程序所列的各項(xiàng)動物毒性試驗(yàn)和體外試驗(yàn)系統(tǒng)是目前管理（法規(guī)）毒理學(xué)評價(jià)水平下所得到的最重要的資料，也是進(jìn)行安全性評價(jià)的主要依據(jù)。結(jié)合其他來源于計(jì)算機(jī)分析、體外試驗(yàn)或體內(nèi)試驗(yàn)的相關(guān)資料，有助于更加全面地解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果、做出科學(xué)的評價(jià)。

8.6 不確定系數(shù)

即安全系數(shù)。將動物毒性試驗(yàn)結(jié)果外推到人時(shí)，鑒于動物與人的物種和個(gè)體之間的生物學(xué)差異，不確定系數(shù)通常為100，但可根據(jù)受試物的原料來源、理化性質(zhì)、毒性大小、代謝特點(diǎn)、蓄積性、接觸的人群范圍、食品中的使用量和人的可能攝入量、使用范圍及功能等因素來綜合確定其安全系數(shù)的大小。

8.7毒物動力學(xué)試驗(yàn)的資料

毒物動力學(xué)試驗(yàn)是對化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行毒理學(xué)評價(jià)的一個(gè)重要方面，因?yàn)椴煌瘜W(xué)物質(zhì)、劑量大小，在毒物動力學(xué)或代謝方面的差別往往對毒性作用影響很大。在毒性試驗(yàn)中，原則上應(yīng)盡量使用與人具有相同毒物動力學(xué)或代謝模式的動物種系來進(jìn)行試驗(yàn)。研究受試物在實(shí)驗(yàn)動物和人體內(nèi)吸收、分布、排泄和生物轉(zhuǎn)化方面的差別，對于將動物試驗(yàn)結(jié)果外推到人和降低不確定性具有重要意義。

9. 再評價(jià)

安全性評價(jià)的依據(jù)不僅僅是安全性毒理學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果，而且與當(dāng)時(shí)的科學(xué)水平、技術(shù)條件以及社會經(jīng)濟(jì)、文化因素有關(guān)。因此，隨著時(shí)間的推移，社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，當(dāng)對原料或產(chǎn)品的安全性研究有新的科學(xué)認(rèn)識時(shí)，應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品上市后營銷過程中發(fā)現(xiàn)的任何安全問題以及管理機(jī)構(gòu)采取的與安全有關(guān)的任何管理措施，對產(chǎn)品的安全性進(jìn)行重新評價(jià)。 

附件2

保健食品用菌種致病性評價(jià)程序

（征求意見稿）

1范圍

本程序規(guī)定了保健食品生產(chǎn)用菌種（包括細(xì)菌、絲狀真菌和酵母）的致病性評價(jià)程序。

本程序規(guī)定了作為保健食品的活性成分（活菌）和作為保健食品生產(chǎn)發(fā)酵用菌株兩類微生物的致病性評價(jià)。

本程序適應(yīng)于保健食品申請審批時(shí)對生產(chǎn)用菌種的致病性評價(jià)，對用擬評價(jià)菌種生產(chǎn)的產(chǎn)品中其他成分的評價(jià)，應(yīng)參照國家相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

本程序不適應(yīng)于基因修飾微生物的致病性評價(jià)。

2術(shù)語和定義

2.1致病性，Pathogenicity

微生物感染宿主造成健康損害引起疾病的能力。

2.2 產(chǎn)毒能力，Toxigenicity

微生物產(chǎn)生對人和動物有毒作用的活性代謝產(chǎn)物的能力。

2.3毒性， Toxicity

   微生物有毒代謝產(chǎn)物引起的宿主健康損傷。

3擬評價(jià)微生物菌種的基本要求

3.1基本信息

菌種名稱(包括學(xué)名、俗名、拉丁名等)、來源及用途。

3.2菌種分類學(xué)資料

提供由有菌種鑒定資質(zhì)的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的對擬評價(jià)菌種規(guī)范、科學(xué)的分類學(xué)（屬、種、株名稱或株號）資料。細(xì)菌的分類和命名應(yīng)遵循原核生物系統(tǒng)學(xué)國際委員會（International Committee on Systematics of Prokaryotes）的規(guī)定，并符合原核生物國際命名法規(guī)（International Code of Nomenclature of Prokaryotes）要求。真菌的分類和命名應(yīng)遵循國際藻類、真菌和植物命名法規(guī)（International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants）進(jìn)行。

3.3菌種鑒定資料

根據(jù)目前已有的知識，提供基于表型或最新基因測序技術(shù)確切鑒定到種水平的資料。

3.4菌種生長環(huán)境條件資料

提供菌種生長最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件（培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和濕度、光照等），以及菌種保藏及復(fù)壯方法等。

3.5誘變菌種

經(jīng)誘變的菌種還需提供詳細(xì)的誘變方法（包括使用的誘變劑、誘變條件及誘變實(shí)驗(yàn)流程等）。

3.6生產(chǎn)相關(guān)信息

包括但不限于安全用于保健食品工業(yè)生產(chǎn)的記錄、工藝流程、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等資料。

3.7 其他國家審批資料

    提供其他國家批準(zhǔn)擬評價(jià)菌種作為保健食品或普通食品生產(chǎn)使用的資料；

3.8其他需要說明的信息。

4評價(jià)方法

4.1 國內(nèi)外安全性評價(jià)資料綜述

基于國內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，提供擬評價(jià)菌種的國內(nèi)外使用歷史、安全性評價(jià)資料，包括其致病性和產(chǎn)毒能力的報(bào)告、科技文獻(xiàn)或綜述等；若無擬評價(jià)菌種的上述資料，應(yīng)提供同種內(nèi)其他菌株或與其相近種屬的安全性評價(jià)資料。

4.2全基因組測序(Whole Genome Sequencing, WGS)

4.2.1基因測序

對擬評價(jià)菌株進(jìn)行全基因組測序，提供包括但不限于以下信息：

-DNA提取方法

-測序方案及儀器設(shè)備

-序列組裝方法

-序列質(zhì)量評價(jià)

-FASTA 文件

-與預(yù)期基因組大小相關(guān)的contigs總長度

-基因注釋流程

-對真菌而言，還需提供從相關(guān)數(shù)據(jù)庫中獲得的注釋質(zhì)量信息。

4.2.2 基因序列分析

將擬評價(jià)菌株的基因組序列與已有的數(shù)據(jù)庫（包括但不限于VFDB、PAI DB、MvirDB、CGE等）最新版本中存儲的序列進(jìn)行比對，并分析擬評價(jià)菌種遺傳物質(zhì)中與致病相關(guān)的已知毒力因子、毒素代謝基因的存在情況。至少提供包括以下信息的分析報(bào)告：

-毒力（或產(chǎn)毒相關(guān)）基因名稱、所在位置、與最新數(shù)據(jù)庫中已有毒力基因的匹配度等信息

-編碼的蛋白及序列號

-毒力因子（毒素產(chǎn)生、侵襲和粘附因子等）

-同源百分比和e值

-數(shù)據(jù)庫中已充分描述過的菌株名稱

- 基因組圖譜

- 擬評價(jià)的真菌菌種還應(yīng)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道能夠產(chǎn)生的毒素類別，針對性檢索是否存在毒素合成關(guān)鍵基因。

4.3動物致病性試驗(yàn)

由有菌種致病性檢測和評價(jià)資質(zhì)的機(jī)構(gòu)，按照附錄A、B和C實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行保健食品用擬評價(jià)細(xì)菌、真菌、酵母菌種對動物的致病性實(shí)驗(yàn)、評價(jià)并出具報(bào)告。

4.4 產(chǎn)毒實(shí)驗(yàn)

對某些能夠產(chǎn)生真菌毒素的真菌，應(yīng)在多種基質(zhì)（單品種固體、多品種固體復(fù)合、不同成分液體組合等）中進(jìn)行產(chǎn)毒實(shí)驗(yàn)，并按照國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法或國際組織/相關(guān)國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法進(jìn)行有毒活性代謝產(chǎn)物含量檢測。

根據(jù)到目前為止我國已批準(zhǔn)可用于保健食品的真菌名單，用于保健食品生產(chǎn)用的紅曲霉屬應(yīng)進(jìn)行桔青霉素產(chǎn)毒實(shí)驗(yàn)。

5結(jié)果判定

5.1出現(xiàn)以下結(jié)果一個(gè)以上者，則認(rèn)為菌株的致病風(fēng)險(xiǎn)較低，可作為保健食品生產(chǎn)用菌種

5.1.1三個(gè)以上國家批準(zhǔn)作為食品或保健食品用菌種且具有長期（30年以上）的使用歷史。

5.1.2全基因序列分析結(jié)果顯示不存在已知的毒力相關(guān)基因或毒素合成關(guān)鍵基因；

5.1.3動物實(shí)驗(yàn)顯示無致病性，

5.1.4產(chǎn)毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在受試的基質(zhì)中均不產(chǎn)生有毒活性代謝產(chǎn)物。

5.2出現(xiàn)以下結(jié)果之一者，則認(rèn)為具有致病風(fēng)險(xiǎn)，不能作為保健食品生產(chǎn)用菌種

5.2.1根據(jù)現(xiàn)有知識，全基因序列分析發(fā)現(xiàn)存在已知毒力基因（或毒素合成關(guān)鍵基因）；

5.2.2動物試驗(yàn)結(jié)果顯示有致病性；

5.2.3產(chǎn)毒實(shí)驗(yàn)顯示在受試的任何一種基質(zhì)中可產(chǎn)生有毒活性代謝產(chǎn)物。

5.3其他需要綜合判斷的情況

5.3.1全基因序列中發(fā)現(xiàn)存在已知毒力基因（或毒素合成關(guān)鍵基因），但動物實(shí)驗(yàn)顯示不具有致病性，或產(chǎn)毒實(shí)驗(yàn)未檢測到已知的有毒活性代謝產(chǎn)物；

5.3.2全基因測序列中未發(fā)現(xiàn)存在已知的毒力基因（或毒素合成關(guān)鍵基因），但動物實(shí)驗(yàn)顯示具有致病性，產(chǎn)毒實(shí)驗(yàn)未檢測到已知的有毒活性代謝產(chǎn)物；

出現(xiàn)上述情況之一者，需結(jié)合國內(nèi)外使用歷史和安全性評價(jià)資料、國內(nèi)外文獻(xiàn)綜述、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)條件、終產(chǎn)品中生產(chǎn)菌種的存在情況等進(jìn)行綜合判斷。 

附錄A

(規(guī)范性附錄)

    保健食品用細(xì)菌致病性試驗(yàn)方法

1  范圍

    本方法規(guī)定了保健食品用細(xì)菌的致病性試驗(yàn)方法。

    本方法適用于保健食品用細(xì)菌的致病性評價(jià)。

2  設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

2.1  恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃。

2.2  電子天平：感量0.1 g。

2.3  錐形瓶：容量500 mL。

2.4  無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.5  無菌試管：16×160 mm。

2.6  顯微鏡：10×～100×。

2.7  微量移液器及槍頭：1.0 mL。

2.8  注射器：1.0 mL。

2.9  小鼠灌胃針頭。

2.10 厭氧培養(yǎng)裝置：厭氧罐、厭氧箱。

2.11 Class II生物安全柜

3  培養(yǎng)基和試劑

3.1  0.85%無菌生理鹽水：商品化的生理鹽水，或8.5gNaCl溶于1000mL生流水中，121℃高壓滅菌15 min，備用。

3.2  LB肉湯培養(yǎng)基：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備LB肉湯培養(yǎng)基，備用。

3.3  LB瓊脂平板：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書配用蒸餾水制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備LB瓊脂平板，備用。

3.4  MRS肉湯培養(yǎng)基：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備MRS肉湯培養(yǎng)基，備用。

3.5  MRS瓊脂平板：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備MRS瓊脂平板，備用。

3.6 雙歧桿菌瓊脂平板：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備雙歧桿菌瓊脂平板，備用。

4  實(shí)驗(yàn)動物

選用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重18.0g～22.0 g。

5 操作步驟

    所有擬評價(jià)的菌株均必須進(jìn)行腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑染毒動物，評價(jià)菌株對動物的致病性。

5.1腹腔注射

5.1.1菌種活化與菌懸液制備

到目前為止我國批準(zhǔn)的可用于保健食品的細(xì)菌菌種主要是雙歧桿菌和乳桿菌，新的申報(bào)菌種在以下描述中歸為其他細(xì)菌。

根據(jù)菌種的培養(yǎng)特征，將雙歧桿菌和乳桿菌接種MRS肉湯、其它細(xì)菌接種LB肉湯，并置適宜的培養(yǎng)條件下（包括培養(yǎng)溫度、濕度，厭氧、需氧、微需氧等）培養(yǎng)一定時(shí)間后，將雙歧桿菌接種MRS瓊脂平板或雙歧桿菌瓊脂平板，乳桿菌接種MRS瓊脂平板，其他細(xì)菌接種LB瓊脂平板，培養(yǎng)一定時(shí)間后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無菌生理鹽水中，充分混勻后，用適量無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度，用比濁法使菌懸液中菌體細(xì)胞的最終濃度不低于5.0×10⁷ CFU/mL。

5.1.2 腹腔注射

小鼠40只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組、雌性小鼠菌懸液組。每只小鼠注射0.2 mL，使每只小鼠注射菌量至少10⁷ CFU/只。

5.1.3動物觀察

動物腹腔注射后每天觀察1次，至少觀察21 d。

觀察動物出現(xiàn)下列（但不限于）異常的情況：（1）皮膚和毛；（2）眼睛和粘膜；（3）呼吸系統(tǒng)；（4）肢體活動；（5）行為方式；（6）特別注意觀察出現(xiàn)振顫、抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現(xiàn)象；（7）體重：注射前及注射后每周所有小鼠稱量，并測量實(shí)驗(yàn)期間死亡的、最終處死的小鼠體重。若小鼠的存活時(shí)間超過1d，記錄其體重變化；（8）盡可能精確記錄小鼠的死亡時(shí)間。

5.2  經(jīng)口灌胃

5.2.1菌種活化與菌懸液制備

 除制備菌懸液濃度不小于2.5×10⁸ CFU/mL外，其他操作步驟同5.1.1。

5.2.2 灌胃

小鼠40只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組、雌性小鼠菌懸液組，分別以2.0 mL/100g·BW的劑量給小鼠灌胃，灌胃前應(yīng)禁食一夜，灌胃后3～4h喂食。

5.2.3 觀察

同5.1.3 。

6  結(jié)果與報(bào)告

對5.1和5.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并進(jìn)行評價(jià)，包括：

擬評價(jià)菌株對動物體重的影響是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；

動物出現(xiàn)異常特征的時(shí)間及癥狀描述、出現(xiàn)異常的動物數(shù)目等，包括每只動物的死亡時(shí)間；

受試物組動物在實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)中毒癥狀或死亡，且對其生長發(fā)育等影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即可判定該菌種無致病性；受試物組動物在試驗(yàn)期間出現(xiàn)中毒癥狀或死亡，或試驗(yàn)期間影響其生長發(fā)育，即可判定該菌種具有致病性。

 附錄B

(規(guī)范性附錄)

    保健食品用絲狀真菌的致病性試驗(yàn)方法

1  范圍

    本方法規(guī)定了保健食品用絲狀真菌的致病性試驗(yàn)方法。

    本方法適用于保健食品用絲狀真菌的致病性評價(jià)。

2  設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

2.1  培養(yǎng)箱：28 ℃±1 ℃。

2.2  電子天平：感量0.1 g。

2.3  錐形瓶：容量500 mL。

2.4  無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.5  顯微鏡：10×～100×。

2.6  微量移液器及槍頭：1.0 mL。

2.8  比濁儀。

2.9  注射器：1.0 mL。

2.10 小鼠灌胃針頭。

2.11 接種針。

2.11 Class II生物安全柜

3  培養(yǎng)基和試劑

3.1  麥芽汁瓊脂平板：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備麥芽汁瓊脂平板，備用。

3.2  馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，備用。

3.3 0.85%無菌生理鹽水：商品化的生理鹽水，或8.5gNaCl溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，備用。

4  實(shí)驗(yàn)動物

選用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重18.0g～22.0 g。

5  操作步驟

    所有擬評價(jià)的菌株均必須進(jìn)行腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑染毒動物，評價(jià)菌株對動物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌種活化與菌懸液制備

將送檢菌種接種于適宜的培養(yǎng)基上，到目前為止我國批準(zhǔn)的可用于保健食品的真菌菌種除了紅曲霉屬菌種接種麥芽汁瓊脂平板外，其他菌種均接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，28℃±1℃培養(yǎng)7 d～14 d后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無菌生理鹽水中，充分混勻后，用適量無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度，用比濁法菌懸液中孢子的最終濃度不低于5.0×10⁷ CFU/mL。

5.1.2注射

小鼠40只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組、雌性小鼠菌懸液組，每只小鼠注射0.2mL，使每只小鼠注射的孢子量不少于10⁷ CFU/只。

5.1.3觀察

動物腹腔注射后每天觀察1次，至少觀察21 d。

觀察動物出現(xiàn)下列（但不限于）異常的情況：（1）皮膚和毛；（2）眼睛和粘膜；（3）呼吸系統(tǒng)；（4）肢體活動；（5）行為方式；（6）特別注意觀察出現(xiàn)振顫、抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現(xiàn)象；（7）體重：注射前及注射后每周稱量所有小鼠的體重，并測量實(shí)驗(yàn)期間死亡的、觀察期內(nèi)存活的、最終處死的小鼠均需稱重。若小鼠的存活時(shí)間超過1d，記錄其體重變化；（8）盡可能精確記錄小鼠的死亡時(shí)間。

5.2經(jīng)口灌胃

5.2.1菌種活化與菌懸液制備

除制備濃度不小于2.5×10⁸ CFU/mL的菌懸液外，其他操作步驟同5.1.1。

5.2.1 灌胃

小鼠40只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組、雌性小鼠菌懸液組，以2.0 mL／100g·BW的劑量給小鼠灌胃，灌胃前禁食一夜，灌胃后3～4h喂食。

5.2.2 觀察

同5.1.3。

6  結(jié)果與報(bào)告

對5.1和5.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并進(jìn)行評價(jià)，包括以下內(nèi)容：

擬評價(jià)菌株對動物體重的影響是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；

動物出現(xiàn)異常特征的時(shí)間及癥狀描述、出現(xiàn)異常的動物數(shù)目等，包括每只動物的死亡時(shí)間；

受試物組動物在實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)中毒癥狀或死亡，且對其生長發(fā)育等影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即可判定該菌種無致病性；受試物組動物在試驗(yàn)期間出現(xiàn)中毒癥狀或死亡，或?qū)嶒?yàn)期間其生長發(fā)育受到影響，即可判定該菌種具有致病性。 

附錄C

(規(guī)范性附錄)

    保健食品用酵母的致病性試驗(yàn)方法

1  范圍

    本方法規(guī)定了保健食品用酵母的致病性試驗(yàn)方法。

    本方法適用于保健食品用酵母的致病性評價(jià)。

2  設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

2.1  培養(yǎng)箱：28 ℃±1 ℃。

2.2  電子天平：感量0.1 g。

2.3  錐形瓶：容量500 mL。

2.4  無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.5  顯微鏡：10×～100×。

2.6  微量移液器及槍頭：1.0 mL。

2.8  比濁儀。

2.9  注射器：1.0 mL。

2.10 小鼠灌胃針頭。

2.11 溫濕度計(jì)。

2.12 接種針。

2.13 Class II生物安全柜

3  培養(yǎng)基和試劑

3.1  麥芽汁瓊脂平板：商品化培養(yǎng)基按照產(chǎn)品說明書用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備麥芽汁瓊脂平板，備用。

3.2  0.85%無菌生理鹽水：商品化的生理鹽水，或8.5gNaCl溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，備用。

4  實(shí)驗(yàn)動物

選用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重18.0g～22.0 g。

5  操作步驟

    所有擬評價(jià)的菌株均必須進(jìn)行腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑染毒動物，評價(jià)菌株對動物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌種活化與菌懸液制備

將送檢菌種接種麥芽汁瓊脂平板，28℃±1℃培養(yǎng)2 d～7 d后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無菌生理鹽水中，充分混勻后，用適量無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度，用比濁調(diào)整菌懸液中菌的最終濃度不低于5.0×10⁷ CFU/mL。

5.1.2注射

小鼠40只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組及雌性小鼠菌懸液組，每只小鼠注射0.2mL，使每只小鼠注射的菌量不少于10⁷ CFU/只。

5.1.3觀察

動物腹腔注射后每天觀察1次，至少觀察21d。

觀察動物出現(xiàn)下列（但不限于）異常情況：（1）皮膚和毛；（2）眼睛和粘膜；（3）呼吸系統(tǒng)；（4）肢體活動；（5）行為方式；（6）特別注意觀察出現(xiàn)振顫、抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現(xiàn)象；（7）體重：注射前及注射后每周稱量所有小鼠的體重，并測量實(shí)驗(yàn)期間死亡的、觀察期內(nèi)存活的、最終處死的小鼠均需稱重。若小鼠的存活時(shí)間超過1d，記錄其體重變化；（8）盡可能精確記錄小鼠的死亡時(shí)間。

5.3經(jīng)口灌胃

5.3.1菌種活化與菌懸液制備

除制備菌懸液濃度不小于2.5×10⁸ CFU/mL外，其他操作步驟同5.1.1。

5.3.1 灌胃

小鼠40只，雌雄各半，分別隨機(jī)分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組及雌性小鼠菌懸液組，以2.0 mL／100g·BW的劑量給小鼠灌胃，灌胃前應(yīng)禁食一夜，灌胃后3～4h喂食。

5.3.2 觀察

同5.1.3。

6  結(jié)果與報(bào)告

對5.1和5.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并進(jìn)行評價(jià)，包括以下內(nèi)容：

擬評價(jià)菌株對動物體重的影響是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；

動物出現(xiàn)異常特征的時(shí)間及癥狀描述、出現(xiàn)異常的動物數(shù)目等，包括每只動物的死亡時(shí)間；

受試物組動物在實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)中毒癥狀或死亡，且對其生長發(fā)育等影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即可判定該菌種無致病性；受試物組動物在試驗(yàn)期間出現(xiàn)中毒癥狀或死亡，或?qū)嶒?yàn)期間其生長發(fā)育受到影響，即可判定該菌種具有致病性。